Marvel’s Spider-Man 2 được xây dựng trên một câu chuyện riêng, tuy nhiên, cốt truyện độc đáo của Insomniac Games đã được truyền cảm hứng từ một số truyện tranh khác nhau.
Cốt truyện chính của Marvel's Spider-Man 2 xoay quanh các hành động của hai tên phản diện Kraven và Venom trong trò chơi.
Mặc dù Insomniac Games đã tuyên bố rằng họ muốn kể một câu chuyện mới mẻ trong Marvel's Spider-Man 2 để đáp ứng sự mong đợi của người hâm mộ, nhưng rõ ràng người chơi có thể nhận thấy rằng nhà phát triển đã lấy cảm hứng từ các bộ truyện tranh nổi tiếng về Spider-Man. Marvel's Spider-Man 2 sẽ kết hợp nhiều cốt truyện khác nhau và liên kết chúng với cốt truyện chính, cùng với sự hiện diện độc đáo của những nhân vật như Dr. Curt Connors và Venom theo phong cách riêng của Insomniac. Bất kể các khác biệt này, vẫn có những ám chỉ rõ ràng đến các nguồn tài liệu làm nền tảng cho cốt truyện của trò chơi.
Cốt truyện chính của Marvel’s Spider-Man 2 tập trung vào hai nhân vật phản diện chính: Kraven và Venom. Mặc dù hai nhân vật này chỉ thỉnh thoảng xuất hiện cùng nhau trong truyện tranh Người Nhện, nhưng trong Spider-Man 2, Insomniac Games đã kết hợp các yếu tố độc lập từ truyện tranh của họ để tạo ra một câu chuyện độc đáo. Nhà phát triển cũng đã rất tỉ mỉ trong việc thể hiện lòng tôn kính đối với những truyện tranh nổi tiếng của Người Nhện, và người hâm mộ siêu anh hùng này có thể dễ dàng nhận ra nguồn cảm hứng cho nhiều yếu tố câu chuyện trong trò chơi.
Kraven’s Last Hunt
Kraven the Hunter được ghi nhận làm một dấu ấn đáng chú ý trong câu chuyện Kraven's Last Hunt, bắt đầu từ tập truyện Web of Spider-Man Vol 1 #31.
Có thể nói rằng sự xuất hiện đáng nhớ nhất của Kraven the Hunter là trong cốt truyện Kraven’s Last Hunt, mà bắt đầu trong tập 31 của Web of Spider-Man Vol 1. Truyện này cho thấy Kraven đã mặc áo Người Nhện và săn lùng, giết chết những kẻ phản diện đáng chú ý nhất của siêu anh hùng này. Spider-Man 2 làm theo cốt truyện này bằng cách khiến Kraven bắt và tiêu diệt những kẻ phản diện như Scorpion và Vulture, dù làm như vậy với tư cách của bản thân mình, không phải là Người Nhện. Cuộc săn cuối cùng của Kraven kết thúc khi hắn hài lòng với cuộc săn của mình và tự sát, tương tự như cách Kraven chấp nhận cái chết của mình sau khi bị Venom đánh bại trong Spider-Man 2.
Ultimate Spider-Man
Trong Ultimate Spider-Man, Eddie Brock đã cố gắng tạo ra một “bộ giáp” có khả năng chữa bệnh bằng cách sử dụng symbiote và một phần của symbiote sẽ liên kết với Peter trong quá trình hợp tác với Brock để hoàn thiện nó.
Dù Ban đầu symbiote Venom xuất hiện trong các truyện tranh sau khi Người Nhện tìm thấy symbiote trên Battleworld trong cốt truyện Secret Wars, Ultimate Spider-Man đã đề xuất một câu chuyện có nguồn gốc khác cho symbiote, gần giống với cốt truyện của Spider-Man 2. Trong Ultimate Spider-Man, Eddie Brock đã cố gắng phát triển một "bộ trang phục" có khả năng chữa lành bệnh tình bằng cách sử dụng symbiote và một phần của symbiote sẽ liên kết với Peter trong quá trình hợp tác với Brock để hoàn thành nó. Trong Spider-Man 2, Eddie Brock được thay thế bởi Harry Osborn, nhưng symbiote được sử dụng tương tự như một phương pháp điều trị cho căn bệnh của Harry trước khi nó liên kết với một Peter đang trên bờ vực chết.
Absolute Carnage
Sau cuộc xâm lược của Dark Carnage Symbiote vào New York, người ta tiếp tục chứng kiến sự diễn ra của Absolute Carnage, khi có sự chiếm hữu và kiểm soát nhân dân New York, cùng việc tạo ra các bản sao của Carnage.
Mặc dù Carnage không xuất hiện trực tiếp trong Spider-Man 2, nhưng anh được đề cập trong nhiệm vụ phụ The Flame và loạt truyện Absolute Carnage đã đóng vai trò là nguồn cảm hứng chính cho một số loại kẻ thù trong trò chơi. Absolute Carnage kể về cuộc xâm lược của Dark Carnage Symbiote vào New York, chiếm hữu người dân và tạo ra các bản sao của Carnage. Điều này được đề cập đến trong phần cuối của Spider-Man 2 khi cuộc xâm lược của symbiote tạo ra các kẻ địch mang hình xăm xoắn ốc tương tự trên đầu, đó là dấu hiệu chứng tỏ chúng đang bị Knull, tổ tiên của symbiote, kiểm soát.
The Amazing Spider-Man
Trong tập truyện tranh này, Martin Li tận dụng năng lực của mình để chữa trị bệnh ung thư của Eddie Brock. Tuy nhiên, trong quá trình điều trị, anh đã gộp một số tế bào cộng sinh của Brock với tế bào của mình, tạo thành một nhân vật mới có tên là Anti-Venom.
Phần cuối cùng của cốt truyện Marvel’s Spider-Man 2 đã biểu thị việc tạo ra bộ trang phục Anti-Venom bằng cách kết hợp các tế bào Năng lượng Trắng của Martin Li với các tế bào symbiote còn lại trong Peter Parker. Nhờ vậy, Peter có thể đối phó với Venom và symbiote bằng sức mạnh Anti-Venom và những sức mạnh này chính là nguồn cảm hứng từ The Amazing Spider-Man Vol 1 #569. Trong truyện tranh này, Martin Li sử dụng năng lực của mình để chữa lành Eddie Brock, người mắc bệnh ung thư, nhưng trong quá trình đó, anh đã kết hợp một số tế bào cộng sinh của Brock với tế bào của mình, từ đó tạo ra Anti-Venom. Điều này khác với cách diễn biến trong Marvel's Spider-Man 2.
